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細(xì)胞爬片免疫熒光實驗操作步驟
點(diǎn)擊次數(shù):619 更新時間:2023-05-18

細(xì)胞爬片免疫熒光步驟:

1.遠(yuǎn)慕生物細(xì)胞爬片;首先是玻片的處理,普通的蓋玻片用砂輪劃成自己要的大小的小方塊,先用洗衣粉洗干凈,用水沖靜烤干,然后泡酸過夜,撈酸后流水洗凈,烤干,置于器皿中高壓滅菌,然后再烤箱中大約8小時烤干備用。

爬片可以在培養(yǎng)皿 六孔板或24孔板中都可,我選擇在培養(yǎng)皿中爬。一為節(jié)約經(jīng)費(fèi)(培養(yǎng)皿可以重復(fù)利用)二來覺得培養(yǎng)皿口大,操作比較方便。培養(yǎng)皿消毒同上,消毒時記得消兩把鑷子

具體操作是:用胰yi酶消化好細(xì)胞,充分吹打,使之成單細(xì)胞懸液(注意:這一點(diǎn)很重要,關(guān)系到將來爬出來片子的質(zhì)量)

取出消毒的培養(yǎng)皿,可以先加少量培養(yǎng)基(以使玻片與培養(yǎng)皿緊密接觸),將玻片小心放入擺放其中,然后將單細(xì)胞懸液一滴一滴的滴到玻片上。最后蓋上培養(yǎng)皿置于37度5%CO2的暖箱中培養(yǎng),根據(jù)細(xì)胞生長狀況,24小時或更長時間適時取出爬片。

爬片置于37度PBS中洗三次,每次3到5秒鐘,然后在4%多聚甲醛中固定15分鐘,然后再用37度去離子水將甲醛沖干凈,注意手法輕柔,要不然掉片很厲害。同時操作過程中注意玻片的正反面,要不然真的是前功盡棄。

將做好的爬片置于濾紙上晾干,然后用中性樹膠粘在載玻片上。注意一定要等中性樹膠徹di干了之后才能做后續(xù)實驗,要不然玻片會掉下來的,就又是前功盡棄了 做好的細(xì)胞爬片可以放在-20保存?zhèn)溆?,具體能保存多長時間不太清楚,當(dāng)然盡量早用。

2.4%多聚甲醛固定10min(固定細(xì)胞器用預(yù)冷的70%甲醇+30%丙酮);

3.PBS漂洗5min;

4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化處理);

5.PBS漂洗2次,每次5min;

6.1%BSA封閉30min;

7.加入1%BSA稀釋的一抗,于37℃雜交2h;

8.PBS漂洗2次,每次5min;

9.加入1%BSA稀釋的二抗,于37℃雜交1h;

10.PBS漂洗2次,每次5min;

11.5ug/ml DAPI染色2min;

12.抗淬滅封片劑封片。

抗淬滅封片劑:

2.5% DABCO (w/v)

50mM Tris(pH8.0)

90%甘油

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