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農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
點(diǎn)擊次數(shù):664 更新時(shí)間:2023-05-19

實(shí)驗(yàn)概要

本實(shí)驗(yàn)介紹了根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞的制備及凍融法轉(zhuǎn)化。

主要試劑

利fu平,LB培養(yǎng)基,NaCl,CaCl2,YEP培養(yǎng)基,ka那霉素

主要設(shè)備

搖床,高速離心機(jī),低溫冰箱,水浴鍋

實(shí)驗(yàn)材料

根癌農(nóng)桿菌GV3101單菌落

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞的制備

1) 挑取單菌落GV3101,接種于5mL附加有50mg/L的利fu平的液體LB培養(yǎng)基中,28℃,200rpm,過夜;

2) 取2mL培養(yǎng)物至50mL液體LB培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.5左右;

3) 將培養(yǎng)物冰浴30min,4℃,5000rpm,離心5min,棄上清;

4) 用l0mL 0.lmol/L冷的NaCl懸浮菌體;

5) 4℃,5000rpm,離心5min,棄上清;

6) 1 mL 20mmo1/L冷的CaCl2懸浮,分裝成50uL/管,液氮速凍后,-80℃保存。

2. 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

1) 冰浴融化農(nóng)桿菌LBA4404/GV3101感受態(tài)細(xì)胞;

2) 加入3ul表達(dá)載體質(zhì)粒,冰浴30min,液氮中凍1 min,然后在37℃水浴5min;

3) 加入950uL無抗生素的YEP培養(yǎng)基,28℃,200rpm,振蕩培養(yǎng)4h;

4) 1 0000rpm離心1 min以濃縮菌液,用100uL YEP回溶菌體;

5) 將回溶后的菌體涂于附加50mg/L卡na霉素和100mg/L利fu平的固體YEP培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)36-48h。菌液PCR檢測陽性克隆。

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