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重組質(zhì)粒(dna recombinant plasmid)的連接簡介
點擊次數(shù):312 更新時間:2023-08-21

  質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點。如果要克隆較小的DNA 片段( <10kb) 且結(jié)構(gòu)簡單,質(zhì)粒要比其它任何載體都要好。在質(zhì)粒載體上進(jìn)行克隆,從原理上說是很簡單的,先用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA 和目的DNA 片段,然后體外使兩者相連接,再用所得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌,即可完成。但在實際工作中,如何區(qū)分插入有外源DNA 的重組質(zhì)粒和無插入而自身環(huán)化的載體分子是較為困難的。通過調(diào)整連接反應(yīng)中外源DNA 片段和載體DNA 的濃度比例,可以將載體的自身環(huán)化限制在一定程度之下,也可以進(jìn)一步采取一些特殊的克隆策略,如載體去磷酸化等來最大限度的降低載體的自身環(huán)化,還可以利用遺傳學(xué)手段如α 互補(bǔ)現(xiàn)象等來鑒別重組子和非重組子。

  外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種:

  1、帶有非互補(bǔ)突出端的片段

  用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)的粘性末端,這也是最容易克隆的DNA 片段,一般情況下,常用質(zhì)粒載體均帶有多個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點,因而幾乎總能找到與外源DNA 片段末端匹配的限制酶切位點的載體,從而將外源片段定向地克隆 到載體上。也可在PCR 擴(kuò)增時,在DNA 片段兩端人為加上不同酶切位點以便與載體相連。

  2、帶有相同的粘性末端

  用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。由于質(zhì)粒載體也必須用同一種酶消化,亦得到同樣的兩個相同粘性末端,因此在連接反應(yīng)中外源片段和質(zhì)粒載體DNA 均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個分子串連形成寡聚物,而且正反兩種連接方向都可能有。所以,必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩種DNA 的濃度,以便使正確的連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到最gao水平。還可將載體DNA 的5' 磷酸基團(tuán)用堿性磷酸酯酶去掉,最大限度地抑制質(zhì)粒DNA 的自身環(huán)化。帶5' 端磷酸的外源DNA 片段可以有效地與去磷酸化的載體相連,產(chǎn)生一個帶有兩個缺口的開環(huán)分子,在轉(zhuǎn)入E. coli 受體菌后的擴(kuò)增過程中缺口可自動修復(fù)。

  3、帶有平末端

  是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生,或由DNA 聚合酶補(bǔ)平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多,故在其連接反應(yīng)中,T4 DNA 連接酶的濃度和外源DNA 及載體DNA 濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進(jìn)DNA 分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化效率。特殊情況下,外源DNA 分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配,則可以在線狀質(zhì)粒載體末端或外源DNA 片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coliDNA聚合酶Ⅰ的klenow 大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)末端或轉(zhuǎn)為平末端后再進(jìn)行連接。

  

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