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預防RNA酶污染,讓實驗不再失?。?/div>
點擊次數(shù):329 更新時間:2023-09-14

  在所有RNA實驗中,最關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定,一般反應不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解,而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果,所以RNA的制備與分析操作難度極大。

  在實驗中,一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活,如煮沸、高壓滅菌等。

  外源性的RNA酶存在 于操作人員的手汗 、唾液等,也可存在于灰塵中。在其它分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染 器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量內(nèi)源性的RNA酶。

  一、防止RNA酶污染的措施

  1.所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。

  2.塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗(注意:有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕,故不能使用)。

  3.有機玻璃的電泳槽等,可先用去污劑洗滌,雙蒸水 沖洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2 O2 室溫10min,然后用0.1% DEPC水沖洗,晾干。

  4.配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC,在37℃處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑,應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水 配制,然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。

  5.操作人員戴一次性口罩、帽子、手套,實驗過程中手套要勤換。

  6.設置RNA操作專用實驗室,所有器械等應為專用。

  二、常用的RNA酶抑制劑

  1.焦磷酸二乙酯(DEPC):是一種強烈但不徹di底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組an酸的咪唑環(huán)結(jié)合 使蛋白質(zhì)變性,從而抑制酶的活性。

  2.異硫氰酸胍 :目前被認為是最you效的RNA酶抑制劑,它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來,又對RNA酶有強烈的變性作用。

  3.氧釩核糖核苷復合物:由氧化釩離子和核苷形成的復合物,它和RNA酶結(jié)合 形成過渡態(tài)類物質(zhì),幾乎能完wan全抑制RNA酶的活性。

  4.RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin ):從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin 是RNA酶的一種非競爭性抑制劑,可以和多種RNA酶結(jié)合,使其失活。

  5.其它:SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。

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